Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева

Состав крови образован плазмой и форменными компонентами, большую часть из которых составляют эритроциты. Зрелые кровяные клетки не содержат ядра и имеют двояковогнутую форму. Главная их функция – транспортировка газов в тканях органов. Уровень эритроцитарных клеток в крови человека зависим от таких факторов, как пол и возраст, но является величиной достаточно постоянной, поэтому колебание их количества дает ценную информацию в процессе диагностирования.

Для вычисления количества кровяных клеток чаще всего используется унифицированный метод подсчета эритроцитов с использованием оборудования, известного, как камера Горяева, либо с помощью электронных счетчиков автоматического типа. Оба способа на данный момент широко используются и в ежедневной лабораторной практике, и при научных изысканиях, так как погрешность результатов, полученных в ходе их применения, минимальна.

Строение камеры Горяева

Оптическое устройство – камера Горяева позволяет вычислить количество кровяных клеток в определенном объёме специальной жидкости. Идея создания устройства принадлежит русскому профессору Горяеву Н. К.

Главный элемент устройства – прозрачное предметное стекло с камерой, образованной углублением в форме прямоугольника, поверхность которой покрыта специальной микроскопической сеткой, и тонкое покровное стекло. Высокая точность результатов подсчета достигается благодаря повышенному объёму сетки в сравнении с аналогичными устройствами других типов.

Сетка устройства имеет площадь 9 мм2, размер одной стороны составляет 3 мм. Поверхность данного элемента образована квадратами общим числом в 225 шт. Из них одна сотня квадратов поделена на прямоугольники, еще столько же – не разграфлено, а 25 штук поделены на 16 более маленьких. Площадь 1 малого квадрата составляет 1/400 мм2, область над ним имеет объём 1/4000 мм3.

Разбавление крови с целью исследования

Определение количества эритроцитов состоит из нескольких последовательных действий. Первым этапом становится разведение определенного объёма крови в реагенте. Делается это в связи с огромным числом форменных элементов.

В качестве реагента чаще всего выступает раствор хлорида натрия концентрацией 0,9%. При необходимости альтернативой служит 5% раствор натрия цитрата. Процедуру разбавления крови выполняют в пробирке или в специальном смесителе, называемом меланжером.

Внимание! Использование растворов с более высокой или низкой концентрацией исключено, так как повлечет за собой разрушение кровяных клеток.

Разбавление крови в меланжере

Меланжером называется изготовленный из стекла градуированный капилляр длинной 10 см с расширением на конце, внутри которого расположен шарик. Последний выполняет важную функцию – равномерное смешивание раствора и крови. Цвет шарика меланжерного капилляра будет красным, если он предназначен для эритроцитов, и белым – для работы с лейкоцитами.

Методика подсчета эритроцитов позволяет проводить процедуру исследования и со стабилизированной кровью, и с нестабилизированным материалом сразу после его забора у пациента.

Кровь набирают меланжерным капилляром до деления 0,5, после чего кончик смесителя очищают от крови с помощью марли либо ватки и следующим действием набирают разбавляющий раствор до деления 101. Перекрыв пальцами отверстия капилляра, полученный образец тщательно смешивают около 3 минут. В счётную камеру помещают четвёртую каплю, предварительно удалив первые три на марлю. Таким образом получают разбавление крови в 200 раз.

Разбавление крови в пробирке

При пробирочном методе разбавления крови исследуемый материал разводят в 200 раз следующим образом: 4 мл раствора хлорида натрия помещают в пробирку, после чего добавляют 0,02 мл крови.

Для этого забор материала производят пипеткой, кончик которой протирают ваткой или другой тканью. Образец крови помещают на дно пробирки, пипетку промывают ближе к поверхности раствором хлорида натрия. Готовый образец перемешивают и оставляют до дальнейшего этапа исследования, но менее чем на 3 часа.

Подсчёт эритроцитов в камере Горяева

Прочитайте:

A) уменьшение содержания эритроцитов в периферической крови
Алгоритм обследования больных анемией, имеющих увеличенные размеры эритроцитов – макроцитоз.
Анемия при снижении продукции эритроцитов
Антигенная система эритроцитов, иммунный конфликт
Выслушивание и подсчёт сердцебиения плода
Гемолиз эритроцитов
Группы эритроцитов по степени эксцентричности (Е)
Дегенеративные формы эритроцитов
Изменения морфологии эритроцитов. Эритропоэз.
Лейкоцитов, тромбоцитов, гематокрита, СОЭ, цветового показателя (насыщенности эритроцитов гемоглобином)

Камера Горяева должна быть сухой и чистой. К ней притирают покровное стекло до появления радужных полос (только при этих условиях соблюдается правильный объем камеры). Смеситель (меланжер) также должен быть чистым и обязательно сухим, на его короткий капилляр надевают резиновую трубку с грушей. В меланжер для эритроцитов (красная палочка в шарообразном расширении) до нижней метки «0,5» набирают кровь, погрузив в нее кончик смесителя; затем до метки «101» за шарообразным расширением 3% гипертонический раствор, в котором эритроциты сморщиваются — кровь разводится в 200 раз. Кровь набирают строго до метки, но если получилось больше, необходимо выпустить на ватку или фильтровальную бумагу. Закончив набор жидкости, переведите смеситель (меланжер) в горизонтальное положение, снимите резиновую трубку, закройте капилляр с обеих сторон большим и указательным пальцами и тщательно перемешайте кровь с жидкостью в расширении смесителя, встряхивая его. Кровь готова для подсчета эритроцитов. Полученной смесью заполняют счетную камеру Горяева. После заполнения камеры оставьте на 1-2 минуты в покое для оседания форменных элементов, приступайте к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (диафрагма прикрыта и несколько опущен конденсор). Эритроциты считают в 5 больших (5 * 16 = 80 малых) квадратах. Подсчёт производят по формуле: Э = А*4000*200*10^6/80

где Э — количество эритроцитов в 1 л крови; А — сумма эритроцитов в 5-ти больших квадратах (80-ти малых); 4000 — множитель, приводящий к объёму крови 1 мкл (объём малого квадрата 1/4000 мкл); 200 — разведение крови (кровь в меланжере разводится в 200 раз); 80 — число малых квадратов; 10^6 — количество мкл в одном литре. Количество эритроцитов в норме:у женщин 3,9-4,7 10^12 /л; у мужчин 4-5 10^12 /л.

Произведите подсчёт количества эритроцитов в 1 л крови, сделайте заключение о соответствии полученных результатов нормативным.

Подсчет количества эритроцитов

Камера Горяева обязательно располагается горизонтально. Всю площадь сетки аккуратно заполняют разведенным образцом. Важно проследить, чтобы не образовались пузырьки воздуха, ведь их наличие значительно исказит результат. В таком положении камера остается в течение одной минуты с целью оседания кровяных клеток.

Унифицированный метод подсчета эритроцитов проходит при среднем увеличении посредством микроскопического осмотра. Подсчет числа эритроцитов в камере Горяева ведут в 5 больших квадратах, поделенных на 16 малых. Начало отсчета рекомендовано производить с большого квадрата, находящегося вверху слева, и далее по диагонали.

Важно! Чтобы количество клеток, находящихся на линиях малых квадратов, не было подсчитано дважды, рекомендуют пользоваться правилом Егорова: в каждом квадрате вести подсчет по двум определенным линиям (верхней и левой).

Начинают высчитывание клеток в малых квадратах в верхнем ряду слева направо от 1-го до 4-го в этом ряду. Переходя к следующему ряду, подсчет ведут в обратном порядке – справа налево. Переход к подсчету клеток в следующем большом квадрате производят после вычисления эритроцитов в этих 16 малых квадратах.

Непосредственно расчет числа эритроцитов ведут по формуле, отображенной на рисунке №2.

Обозначения в данной формуле расшифровываются следующим образом:

X – искомое число красных кровяных клеток в 1 мкл крови,
A обозначает количество сосчитанных клеток,
200 – разбавление крови,
80 – это количество малых посчитанных квадратов,
1/4000 – объем маленького квадрата.

Внимание! Для достоверности результата расчет кровяных клеток при некоторых видах анемии необходимо проводить непосредственно после забора материала.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ (RBC)

В настоящее время для определения количества эритроцитов используют два метода: подсчет эритроцитов в счетной камере Горяева и с помощью автоматических счетчиков и анализаторов. Для подсчета эритроцитов кровь из пальца набирают в пипетку до метки 0,02 мл и выдувают ее в пробирку с 4,0 мл изотонического раствора натрия хлорида (или реактива Гайема), несколько раз промывая пипетку этим раствором. Таким образом, получают разведение крови в 200 раз.

Подсчет в счетной камере. Подсчет форменных элементов проводят под микроскопом в строго определенном количестве квадратов камеры Горяева, после чего делают пересчет числа эритроцитов на 1 мкл и 1 л крови с учетом объема квадратов и разведения крови. Для подсчета эритроцитов берут 0,02 мл крови, разведенной в 200 раз в 4,0 мл изотонического раствора натрия хлорида или раствора Гайема (смесь ртути хлористой, натрия сульфата, натрия хлорида и дистиллированной воды). Счетная камера представляет собой толстую стеклянную пластину (предметное стекло) с углублением в центре, равным 0,1 мм. На дне камеры нанесены 2 сетки Горяева, разграниченные поперечной канавкой. Сбоку от сеток расположены стеклянные прямоугольные пластины, к которым притирается шлифованное покровное стекло. Каждая сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены еще на 16 малых квадратов каждый. Сторона большого квадрата равна 0,2 мм, сторона малого квадрата — в 4 раза меньше (0,05 мм). Соответственно, площадь большого квадрата составляет 0,04 мм2 (4×10-2 мм2), малого квадрата — 0,0025 мм2 (25×10-4 мм2). Если учитывать глубину камеры, равную 0,1 мм, то объем одного малого квадрата сетки Горяева составит 2,5×10-4 мкл.Перед заполнением кровью счетную камеру и покровное стекло тщательно протирают и высушивают. Подушечками больших пальцев покровное стекло плотно прижимают к боковым пластинам камеры и слегка передвигают его вверх и вниз до тех пор, пока не появятся радужные полосы («ньютоновые кольца»). Только в этом случае соблюдается должный объем камеры. Перед заполнением камеры взвесью крови в изотоническом растворе или растворе Гайема содержимое пробирки несколько раз встряхивают. После этого подносят каплю разведенной крови к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно заполняла всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в боковые бороздки. Если это случится, взвесь крови удаляют фильтровальной бумагой. После заполнения камеры ее оставляют на 1–2 минуты в горизонтальном положении для оседания эритроцитов. Подсчет эритроцитов проводят при малом увеличении микроскопа (объектив 8x, окуляр 10x), в несколько затемненном поле зрения (при прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре). Эритроциты подсчитывают в 5 расположенных по диагонали сетки квадратах, разделенных на малые, т. е. в 80 малых квадратах. Для этого под микроскопом находят верхний левый квадрат сетки (разделенный на 16 малых) и подсчитывают число эритроцитов в нем. При этом целесообразно придерживаться определенной последовательности подсчета эритроцитов: передвигаться из одного малого квадрата в другой по горизонтали, например, один ряд справа налево, другой ряд слева направо. В каждом малом квадрате подсчитывают эритроциты, находящиеся внутри него, а также расположенные на левой и верхней границе квадрата, пропуская эритроциты, лежащие на нижней и правой границе. Это позволяет добиться того, чтобы форменные элементы, расположенные на границе квадратов, не попали в счет дважды. Количество эритроцитов в 1 мкл (1 мм3) крови рассчитывают по следующей формуле, где Х — число эритроцитов в 1 мкл крови, а — число сосчитанных эритроцитов, b — объем малого квадрата (2,5×10-4 мкл), 200 — разведение крови, 80 — число малых квадратов,

в которых производился счет. Введя в эту формулу значение объема одного малого квадрата сетки Горяева, получим упрощенную формулу X=ax200/bx80.Количество эритроцитов в 1 мкл (Х) равно числу форменных элементов крови, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 104 Х=А´104. Например, в 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 эритроцитов. Тогда количество эритроцитов в 1 мкл составит 4 560 000, или примерно 4,5×106/мкл. Учитывая, что в 1 л жидкости содержится 106 мкл, число подсчитанных эритроцитов можно выразить следующим образом: 4,5×1012/л. Это последнее обозначение числа форменных элементов является в последние годы общепринятым.

Автоматическое определение количества эритроцитов. Поскольку подсчет количества эритроцитов в камере Горяева представляет собой весьма трудоемкое исследование, в последние годы в клинической практике все чаще используют специальные автоматические счетчики форменных элементов крови и гематологические автоматы, работа которых основана на разных принципах. Большое распространение получили автоматические приборы, принцип работы которых основан на кондуктометрическом методе. Определенное количество крови, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида, пропускают через микроотверстие диаметром 100 мкм, с обеих сторон которого расположены электроды. Проходящая через отверстие клетка крови изменяет сопротивление между электродами, которое фиксируется электронным устройством.

Характерно, что величина повышения электрического сопротивления зависит от объема клетки и некоторых других характеристик. Это позволяет автоматически рассчитывать не только общее количество эритроцитов, но и измерять объем клеток и некоторые другие показатели.

Интерпретация результатов

В норме количество эритроцитов у мужчин составляет 4,0×1012/л–5,5×1012/л, а у женщин — 3,5×1012/л– 5,0×1012/л.

Снижение количества эритроцитов наиболее часто встречается в клинической практике и является одним из характерных признаков анемий и острой кровопотери. Следует помнить, однако, о возможности относительной эритроцитопении, связанной с увеличением объема плазмы (гидремия), за счет усиленного притока тканевой жидкости в период схождения сердечных или почечных отеков или при введении в кровяное русло больших количеств жидкости (внутривенные инфузии) и т. п. Дифференцирование этих двух состояний обычно не представляет больших трудностей для клинициста, если проводится тщательный анализ клинической картины заболевания.

Повышение количества эритроцитов (эритроцитоз) может быть обусловлено двумя причинами:

1.Эритремией

(полицитемией, болезнью Вакеза) — заболеванием, в основе которого лежит миелопролиферативный процесс в костном мозге. Заболевание относится к числу гемобластозов и обычно сопровождается пролиферацией других ростков кроветворения. В этих случаях выраженный эритроцитоз обычно сочетается с лейкоцитозом и тромбоцитозом.

2.Вторичными симптоматическими реактивными эритроцитозами

, которые могут быть абсолютными и относительными.

Вторичные абсолютные эритроцитозы

обусловлены усилением нормального гемопоэза в костном мозге. Они характеризуются увеличением объема циркулирующих эритроцитов при малоизмененном объеме циркулирующей крови. Во многих случаях вторичный эритроцитоз обусловлен гипоксией органов, в частности, гипоксией почек, что сопровождается усиленной выработкой эритропоэтических факторов, стимулирующих эритропоэз. Повышенное образование эритропоэтинов характерно также для многих заболеваний почек. При некоторых опухолях, помимо эритропоэтинов, стимуляция эритропоэза может быть связана с усиленной выработкой глюкокортикостероидов (опухоль коркового слоя надпочечников, аденома гипофиза).

Вторичный относительный эритроцитоз

возникает в связи с уменьшением объема плазмы при неизмененном объеме циркулирующих эритроцитов. При этом уменьшается также общий объем циркулирующей крови. Наиболее частыми причинами вторичных относительных эритроцитозов являются заболевания и синдромы, сопровождающиеся быстрой и массивной потерей жидкости:

а) неукротимая обильная рвота;

б) диарея (энтериты, холера и др.);

в) массивные ожоги;

г) шок.